Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa , abreviado PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction ), es una técnica de biología molecular que permite la multiplicación ( amplificación ) de fragmentos de ácido nucleico de los que se conocen las secuencias de nucleótidos inicial y terminal . La amplificación por PCR permite obtener in vitro muy rápidamente la cantidad de material genético necesario para posteriores aplicaciones .

Este método fue ideado en 1983 por Kary Mullis , [1] por el que recibió el Premio Nobel de Química en 1993. [2]

Mecanismo de funcionamiento

La PCR in vitro reconstruye un paso específico de la duplicación celular: la reconstitución ( síntesis ) de un segmento de ADN "completo" (doble cadena) a partir de una cadena sencilla. La hebra faltante se reconstruye a partir de una serie de nucleótidos (los "bloques de construcción" elementales que componen los ácidos nucleicos) que se disponen en la secuencia correcta, complementaria a la del ADN afectado.

Este proceso lo llevan a cabo en la naturaleza enzimas denominadas ADN polimerasas , que son capaces de sintetizar progresivamente una nueva hebra de ADN en las siguientes condiciones:

Por lo tanto, es posible reconstruir las condiciones que conducen a la formación de nuevos segmentos de ADN, poniendo en solución:

Para iniciar la reacción de la polimerasa (fase de extensión del filamento a partir del cebador 5 '), primero es necesario prever la separación de las hebras de ADN ( fase de desnaturalización ), luego crear el enlace entre los cebadores y sus regiones complementarias de los filamentos de ADN desnaturalizado ( fase de recocido ). Sin embargo, este proceso es incompatible con la ADN polimerasa humana, que se destruye a las temperaturas necesarias para la desnaturalización (96-99 °C).

Para superar este inconveniente, se utilizan polimerasas pertenecientes a organismos termófilos que no se inactivan a altas temperaturas, por ejemplo la polimerasa Taq procedente de la bacteria termófila Thermus aquaticus . Esto permite realizar varios ciclos de PCR en secuencia, en cada uno de los cuales también se duplica el ADN sintetizado en las fases anteriores, obteniendo una reacción en cadena que permite una multiplicación extremadamente rápida del material genético de interés.

Esquema de un ciclo de PCR

  1. La solución de ADN a replicar, desoxirribonucleótidos trifosfatos, iones de magnesio, cebador y TAQ polimerasa se lleva a una temperatura entre 94 y 99 °C. En consecuencia, nos encontramos en una situación en la que la doble hélice del ADN está completamente escindida y las dos hebras que la componen quedan libres ( fase de desnaturalización ).
  2. Posteriormente, se baja la temperatura a unos 40-55 °C para permitir la unión de los cebadores a sus regiones complementarias de las hebras de ADN desnaturalizadas ( fase de hibridación ).
  3. Finalmente, la temperatura se eleva hasta 65-72 °C para maximizar la acción de la polimerasa TAQ que determina una elongación de los cebadores unidos , utilizando la cadena única de ADN como plantilla (fase de extensión ).

El ciclo descrito se repite generalmente unas 20-30 veces. Por lo general, no se superan los 25-30 ciclos, ya que en algún momento la cantidad de ADN obtenido alcanza una meseta . Esto ocurre, por ejemplo, por falta de oligonucleótidos utilizados como cebadores o por disminución de dNTP. También se debe considerar que cualquier material genómico contaminante también podría amplificarse en exceso .

Eficiencia

En teoría, cada ciclo debería duplicar la cantidad de ADN; sin embargo, esto no se logra. Para tener una estimación suficientemente fiable del número de hebras de ADN obtenidas después de los ciclos, se puede utilizar la fórmula: [3]

Dónde está:

= ADN producido después de los ciclos = cantidad inicial de ADN presente = número de ciclos de PCR realizados = eficiencia de amplificación (generalmente entre 0,7 y 0,8)


Configuración de una PCR

La elección del objetivo

La elección de la diana genética a amplificar por PCR depende de lo que se esté interesado en obtener y por ello se utilizan diferentes estrategias como, por ejemplo:

La diana a amplificar también puede ser una molécula de ARN (como, por ejemplo, en el caso de algunos virus) que debe, como primer paso, someterse a una reacción de retrotranscripción .

La cantidad de material objetivo

Se puede usar una pequeña cantidad de diana para realizar una PCR ya que la sensibilidad de la reacción es muy alta. Se ha encontrado que 100 ng de ADN genómico son suficientes para identificar un gen diana que está presente en una sola copia. Sin embargo, la presencia de una cantidad baja de diana aumenta la probabilidad de que se amplifiquen secuencias no específicas.

Una cantidad demasiado alta de ADN, por otro lado, puede disminuir la eficiencia de la amplificación debido a la presencia de demasiados contaminantes y puede dificultar la evaluación del rendimiento de la reacción durante los procesos de optimización de los parámetros individuales para tratar de configurar. todos los PCR. Durante las fases de preparación de una PCR sería bueno, para evitar los problemas que acabamos de comentar, intentar optimizar la cantidad de ADN utilizada (aunque esto no siempre sea posible) enviando una serie de reacciones de amplificación en las que se controlen todos los parámetros. fijo excepto la cantidad de ADN que se utiliza en dosis escalares.

Para ello, sin embargo, es necesario poder evaluar la cantidad de ADN obtenido durante el proceso de extracción y esto se puede obtener mediante una lectura espectrofotométrica de una alícuota del extracto en el que se mide la absorbancia a 260 nm, y teniendo en cuenta que un valor de absorbancia de 1 con un paso de 1 cm corresponde a 50 µg/ml de ADN bicatenario y 40 µg/ml de ADN o ARN monocatenario. Además, realizando una lectura a una longitud de onda de 280 nm (pico de absorbancia de las proteínas , principal contaminante de los extractos) y realizando la relación entre las respectivas absorbancias a 260 y 280 nm es posible obtener una estimación de la pureza del ADN obtenido (generalmente en preparaciones puras de ADN o ARN esta relación es de 1,8 y 2,0 respectivamente). La lectura a 230 nm, en cambio, refleja la presencia de contaminantes como: fenol , compuestos aromáticos, péptidos y carbohidratos . La relación entre la absorbancia a 260 nm y la de 230 nm permite resaltar la contaminación por estos agentes (en las preparaciones puras es de 2,2).

Las preparaciones en las que las proporciones indicadas anteriormente difieren significativamente de las de las preparaciones puras son un indicio de contaminación y esto hace que la estimación de la concentración de ADN obtenida sea menos precisa. Otros factores que pueden afectar la eficiencia de la amplificación son: la presencia de ADN circular y su peso molecular . De hecho, la eficiencia de amplificación es ligeramente inferior en moléculas de ADN circulares o de peso molecular demasiado alto por lo que, en estos casos, es recomendable utilizar enzimas de restricción adecuadas que permitan, respectivamente, linealizar el material genómico o reducir en fragmentos más pequeños.

Los controles

La elaboración de controles de calidad adecuados permite evaluar la sensibilidad y especificidad del método, así como destacar la presencia de falsos positivos o falsos negativos . Los controles a utilizar se denominan "positivo" y "negativo".

El control positivo consta de una muestra que contiene la secuencia diana. Este control no debe contener un número demasiado elevado de copias de la secuencia diana (normalmente entre 10 5 y 10 6 ). Esto es para evitar crear aerosoles peligrosos que puedan contaminar otras muestras o subestimar posibles caídas en la sensibilidad de la reacción con la producción de falsos negativos.
El control negativo consta de una muestra en la que falta la secuencia diana. Se utiliza para resaltar cualquier contaminación que pueda referirse tanto a la extracción del material genómico como a la preparación de la PCR.

Los cebadores

La elección de los primers a utilizar es un aspecto esencial para el éxito de la PCR. De hecho, deben ser capaces de hibridar de forma específica y eficiente a la secuencia de interés, dejando fuera a las no específicas. El tipo de cebador a utilizar varía según la finalidad de la PCR.

En el caso de enfermedades infecciosas , es conveniente utilizar cebadores que sean específicos de especie o que puedan distinguir eficazmente entre cepas patógenas y no patógenas. En cambio, se pueden utilizar dos estrategias para el diagnóstico de patologías genéticas: cebadores que sean complementarios a regiones adyacentes a aquella en la que se encuentra la mutación a identificar o cebadores en los que uno de los dos sea complementario a la secuencia mutada. En este último caso, en ausencia de la mutación, no habrá producto de amplificación. Dado que la complementariedad de los cebadores con respecto a las secuencias diana puede no ser absoluta, se puede recurrir al uso de cebadores que contengan algunos nucleótidos no complementarios (para crear, por ejemplo, sitios de escisión para enzimas de restricción) o cebadores degenerados ( es decir, mezclas de oligonucleótidos que varían entre sí debido a la presencia de diferentes bases en puntos específicos). Estos últimos permiten identificar genes de los que sólo se conoce la secuencia proteica o genes homólogos entre especies diferentes.

Al configurar una PCR, la distancia entre los dos cebadores es bastante flexible y puede oscilar entre 100 y 10.000 pares de bases (aunque, en realidad, la eficiencia de amplificación disminuye cuando se superan los 3000 pares de bases). Para intentar superar este problema, se han construido variantes de la ADN polimerasa sin actividad exonucleasa (que van de 5' a 3'). La longitud de un cebador está generalmente entre 20 y 30 pares de bases y no debe ser inferior a 16 (para no comprometer la especificidad del proceso).

Gracias a las bases de datos y publicaciones científicas, cada vez están más disponibles las secuencias de ADN o ARN necesarias para poder diseñar los cebadores que se utilizarán en la PCR. Una vez obtenida la secuencia de interés, es necesario comprobar que en el resto del genoma no existen secuencias homólogas que puedan dar lugar a la producción de falsos positivos y entonces se puede empezar a diseñar los cebadores teniendo en cuenta algunas precauciones:

La concentración con la que comúnmente se utilizan los cebadores es de alrededor de 1 mM y se cree que tal cantidad es suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. Una concentración de cebador demasiado alta podría conducir a la amplificación de secuencias no específicas, mientras que, por el contrario, una presencia de cebador demasiado baja hace que la PCR sea ineficaz. Para montar una PCR, por tanto, será necesario optimizar la concentración de los primers , mediante diluciones escalares.

Magnesio

La concentración de magnesio es sin duda el factor más crítico en todas las PCR. Este parámetro debe estar sujeto a un cuidadoso procedimiento de optimización ya que puede variar incluso si se utilizan diferentes cebadores para amplificar la misma región de ADN. La presencia de magnesio condiciona la actividad de la polimerasa, la hibridación de los cebadores y aumenta la temperatura a la que se desnaturaliza el molde de ADN.
Dada la gran importancia del magnesio, se debe tener cuidado de que en la solución de reacción no haya una cantidad excesiva de agentes quelantes (p. ej., EDTA ) o grupos cargados negativamente (p. ej., grupos fosfato) ya que ambos pueden capturar el magnesio presente haciéndolo no disponible. . En consecuencia, para configurar una PCR, es bueno configurar diferentes mezclas de reacción que contengan cantidades progresivamente escalares de magnesio que van desde un mínimo de 0,05 mM hasta un máximo de 5 mM (la mayoría de las veces se usa magnesio 1,5 mM).

Nucleótidos

Generalmente, los nucleótidos se utilizan a una concentración de 200 µM cada uno. Un aumento en esta concentración no conduce a un aumento en la eficiencia de la reacción ya que los grupos fosfato cargados negativamente pueden unirse al magnesio de la mezcla haciéndolo menos disponible. Los nucleótidos, en concentraciones superiores a 200 µM, pueden aumentar el porcentaje de error de la polimerasa o incluso inhibirla si están presentes en concentración milimolar.

La enzima

En los primeros estudios de PCR se utilizó un fragmento de ADN polimerasa de Escherichia coli (llamado fragmento Klenow) obtenido por digestión enzimática. Lamentablemente, las temperaturas requeridas para la desnaturalización del ADN desactivaron esta enzima que tuvo que reinsertarse en el tubo después de cada paso de desnaturalización. La posterior introducción de la polimerasa Taq, una polimerasa termoestable , permitió solucionar este inconveniente bastante molesto.
La polimerasa Taq también permitió una mejora en la especificidad de la PCR, ya que permitió el uso de temperaturas de hibridación y elongación más altas que las posibles con el fragmento Klenow, lo que hace que la reacción sea más estricta. De hecho, la polimerasa Taq tiene un pico de actividad enzimática alrededor de 75-80 ° C y también permite amplificar fragmentos de más de 400 b (límite del fragmento Klenow), hasta un máximo de 10 Kb.
La polimerasa Taq, a diferencia de otras polimerasas, exhibe actividad de exonucleasa 5'-3' pero no en la dirección 3'-5'. En la dirección 3'-5' se permite a las polimerasas, incluido el fragmento Klenow, corregir eventuales errores (correctores de lectura) debidos a una incorrecta incorporación de nucleótidos. Esto hace que la polimerasa Taq tenga una tasa de error de 2 x nucleótidos, valor que sin embargo puede variar modulando adecuadamente algunos parámetros como:

Afortunadamente, esta tasa de error es irrelevante para la mayoría de las aplicaciones posteriores, como la secuenciación o el uso de sondas específicas.
La investigación, sin embargo, estaba dirigida a encontrar otras polimerasas con una menor frecuencia de error y con una mayor resistencia a las altas temperaturas. Esto motivó la comercialización de otras enzimas como las obtenidas por purificación a partir de Thermococcus Litoralis , Pyrococcus furiosus o Thermotoga maritima . El primero, de hecho, asocia una alta termorresistencia con una mayor fidelidad en la síntesis del filamento complementario mientras que los otros presentan una interesante actividad correctora.
El fragmento Stoffel es una ADN polimerasa que se obtiene eliminando los 289 aminoácidos de la porción N-terminal de la polimerasa Taq. Esto hace que la enzima resultante esté desprovista de actividad exonucleasa 5'-3' y tenga una mayor resistencia a las altas temperaturas (de hecho tiene una vida media de unos 20 minutos a 97,5 °C). Tal característica permite el uso de temperaturas de desnaturalización más altas que las habituales y facilidad en la síntesis de fragmentos ricos en guanina y citosina que tienen una estructura secundaria algo elaborada. Otra característica favorable es que tiene una actividad óptima en un amplio rango de concentración de magnesio, entre 2 y 10 mM. Esto puede facilitar su uso en caso de PCR que amplifique más de una diana (PCR multiplex).
La ADN polimerasa, extraída de Thermus aquaticus y posteriormente producida de forma recombinante, tiene, además de la acción clásica, una actividad de transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN) que se produce en presencia de cloruro de manganeso a una temperatura de unos 60 °C. La ADN polimerasa dependiente de ADN se activa con la adición de cloruro de magnesio que quela el manganeso . Esta enzima también parece resistir bien a cualquier componente de la sangre capaz de inhibir la polimerasa Taq, por lo que encuentra aplicabilidad en el campo del diagnóstico de laboratorio donde es necesario utilizar una diana de ARN.
También está disponible comercialmente la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold, que puede activarse gradualmente después de la exposición a 95 ° C durante 10 minutos. Esta activación, que se enmarca dentro del concepto de PCR “ hot start ”, permite aumentar la sensibilidad y especificidad de la reacción. Finalmente, es muy útil en PCR multiplex ya que reduce la unión no específica de los primers y la formación de dímeros.
La cantidad de enzima a utilizar también puede ser un factor limitante en la precisión de la PCR, ya que si la concentración es demasiado baja, el rendimiento del producto amplificado es bajo, mientras que si es demasiado alta, se pueden generar productos no específicos. . Muy a menudo se utiliza una cantidad de enzima que varía entre 1 y 5 unidades por 100 µl. En general, se utilizan cantidades más altas de la enzima para amplificar material genético complejo, como la genómica .

Los parámetros a adoptar

En el paso de desnaturalización, como se ha dicho anteriormente, debe tener lugar la separación completa de las dos cadenas de ADN. Este es un momento importante ya que una desnaturalización incompleta puede comprometer la eficiencia de la amplificación. La desnaturalización se produce con bastante rapidez, pero hay que asegurarse de que la temperatura alcanzada sea homogénea en todo el tubo de reacción. La mayoría de las veces la temperatura utilizada es de 94°C durante 30-60 segundos pero hay que tener en cuenta que existen muchas variables que pueden requerir un ajuste de estos valores:

Hay que tener en cuenta que aumentos excesivos de temperatura o prolongados demasiado pueden disminuir la actividad de la ADN polimerasa que a 95°C tiene una vida media de 40 minutos. Para evitar problemas similares, se puede recurrir a agentes (como la formamida ) que desestabilizan los puentes de hidrógeno para poder disminuir la temperatura de desnaturalización.
En la fase de recocido , en la que los cebadores aparecen a las secuencias complementarias de la diana, la temperatura a utilizar, y su duración, debe elegirse teniendo en cuenta dos aspectos opuestos. Una temperatura más alta, de hecho, aumenta la especificidad de la reacción, pero puede comprometer su eficiencia, ya que favorece la separación de los cebadores del objetivo (el valor de la temperatura a la que hay una transición del 50% entre el estado de doble y simple hélice se denomina fusión o temperatura de fusión). Si se baja la temperatura, las condiciones se vuelven menos estrictas pero se favorece la formación de híbridos, y por tanto de híbridos amplificados, inespecíficos.
Una guía útil para evaluar la temperatura de recocido a adoptar puede ser la composición del par GC. Si estos son pocos, entonces la temperatura puede estar por debajo de los 55 °C, de lo contrario debe ser mayor. Una fórmula empírica para establecer la temperatura de fusión de un oligonucleótido ( cebador ) puede ser la siguiente:

donde A, G, C, T representan el número, respectivamente, de adeninas, guaninas, citosinas y timinas.

La temperatura de recocido se establece generalmente restando 5 a la temperatura de fusión calculada según la fórmula anterior. La temperatura de hibridación así obtenida puede ser un buen punto de partida para los primeros intentos de montar la PCR y posteriormente variarla, en ensayos posteriores, para intentar mejorar el rendimiento o minimizar la presencia de productos inespecíficos.
En la fase de extensión, la temperatura a adoptar es la que corresponde a la máxima actividad enzimática (por ejemplo, se utiliza una temperatura de 70-72 °C con la polimerasa Taq). El periodo de tiempo en el que se utiliza esta temperatura varía según la longitud del fragmento a amplificar (La polimerasa sintetiza 600-1000 bases por minuto), para la Taq polimerasa un minuto es suficiente para fragmentos de 2 Kb. Generalmente, el último El ciclo de la reacción de amplificación dura más para obtener productos lo más completos posible. Este paso es extremadamente importante en situaciones donde los productos de reacción deben tener extremos bien definidos, para poder usarlos, por ejemplo, en secuenciación o clonación.

Contaminaciones

Paradójicamente, el mayor problema de la PCR deriva de su alta sensibilidad y eficiencia. De hecho, la reacción es muy sensible a la presencia de material genético contaminante que se puede encontrar en diferentes lugares: instrumentación, operador, ambiente externo. Una de las principales fuentes de contaminación consiste en la apertura de tubos que contienen material amplificado (contaminación por arrastre ) que, tras la apertura del contenedor, puede dispersarse en el aire en forma de aerosoles que podrían contaminar PCR posteriores.
Si consideramos, de hecho, que en una PCR realizada en un volumen de 100 µl se pueden encontrar hasta 10 12 moléculas de ADN, esto significa que en 10 −7 μl de solución hay 10 3 hebras de ADN, que pueden constituyen una fuente peligrosa de contaminantes.
El problema de la contaminación es tanto mayor cuando la sensibilidad de la PCR es alta. Una PCR menos sensible obviamente será menos propensa a la contaminación pero requerirá una mayor presencia de su diana para poder amplificarla.
Otro aspecto que debe ser considerado es la presencia de material contaminante de origen ambiental o celular. Al querer, por ejemplo, amplificar material genómico humano, existirá la posibilidad de que el mismo operador sea fuente de contaminación (por ejemplo, por pérdida de fragmentos de piel que se pelan o por liberación de gotitas de saliva). Cuando se trata de microorganismos puede existir la posibilidad de que crezcan en las proximidades de los lugares donde se prepara la PCR. También es posible la contaminación cruzada del material utilizado como control positivo que podría depositarse en los tubos de ensayo.
Finalmente, existe otra posibilidad de contaminación que puede ocurrir durante los procedimientos de detección del producto de PCR (por ejemplo, en gel de agarosa para la ejecución electroforética ). En este caso, es posible que el material de una muestra se agregue en pequeñas cantidades a otra con la posibilidad de un resultado falso.
Ante un problema tan importante como el de la contaminación (piénsese sobre todo en el campo del diagnóstico) conviene que se tomen las medidas adecuadas para minimizar este riesgo.
Es absolutamente imprescindible que la zona de preparación de la mezcla de reacción sea distinta de aquella en la que se inoculan las muestras y de aquella en la que se analizan. Esto también se aplica a todos los instrumentos a utilizar. El propósito de esto es evitar que cualquier material genómico contamine la solución mientras se prepara.
Todos los reactivos de PCR deben dividirse en alícuotas bastante pequeñas para evitar que un tubo se abra y cierre demasiadas veces. En caso de presencia de material contaminante, pues, no será necesario desechar todo el reactivo que se considere contaminado sino sólo la parte del mismo que haya sido utilizada.
Además, los reactivos deben almacenarse en áreas donde no haya otros productos de PCR ni ADN extraído.
Las pipetas utilizadas en los laboratorios son una de las principales fuentes de contaminación ya que, durante la fase de aspiración de una solución que contiene ADN, pueden generar aerosoles que se depositan en la punta y que posteriormente pueden contaminar otras muestras (especialmente los controles negativos). Para superar este problema, es recomendable utilizar puntas provistas de filtro o pipetas con eyección positiva. Otro expediente útil a utilizar consiste en el uso de diferentes pipetas para la preparación de la mezcla de reacción y para la inoculación del ADN.
Todas estas medidas deben, por supuesto, situarse en un contexto general de buenas prácticas de laboratorio que debe incluir, entre otras cosas: el cambio frecuente de guantes, la limpieza a fondo de todas las superficies e instrumentos y el cierre de todos los tubos inmediatamente después de la su uso.

Aplicaciones

La PCR se utiliza en todas aquellas situaciones en las que es necesario amplificar una cantidad de ADN hasta niveles útiles para análisis posteriores. Los campos de aplicación son enormes. La técnica se utiliza, por ejemplo, en medicina para el diagnóstico microbiológico o para la detección de células tumorales, en tumores líquidos, cuando son demasiado pocos para ser detectados por otros métodos ( enfermedad mínima residual ). Extremadamente útil es el uso de PCR en medicina forense .

En biología, la PCR se utiliza para análisis de paleontología y antropología molecular y en numerosos campos de la ingeniería genética . Su uso también es fundamental para el estudio del genoma de organismos no cultivables, como numerosas bacterias y protistas, y para el estudio de poblaciones en ecología. Su uso también permite la detección de contaminación por OGM y cualquier enfermedad genética. Los diferentes grados de especificidad de los cebadores integrados con la diferente eficiencia con la que se unen a los amplificados en función de la temperatura garantizan a esta técnica una extraordinaria flexibilidad para estudios en los diferentes niveles taxonómicos.

Variantes

Actualmente existen variantes de la PCR clásica que incluyen:

Notas

  1. ^ Kary Mullis, Reacción en cadena de la polimerasa : hacer que el ADN sea accesible , en karymullis.com . Consultado el 15 de mayo de 2013 .
  2. ^ Premio Nobel de Química, 1993
  3. ^ Ramakers, C., Ruijter, J., Deprez, R. y Moorman, A. (2003). Análisis sin suposiciones de datos cuantitativos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real . Cartas de neurociencia, 339 (1), 62–66.

Otros proyectos

Enlaces externos