Citometría de flujo

La citometría de flujo es una técnica de laboratorio biomédico que utiliza un haz de luz láser para la detección, el recuento, la caracterización y, mediante herramientas avanzadas, la separación de células en suspensión . La citometría de flujo utiliza un instrumento, el citómetro de flujo, que puede medir simultáneamente algunos parámetros morfológicos derivados del cruce de células individuales por un haz de luz láser. El instrumento se llama flujo porque las células fluyen rápida e individualmente a través del haz de luz que las incide.

La citometría de flujo se utiliza de forma rutinaria en el diagnóstico de trastornos de la sangre, pero también, a través de la degradación de tejidos, de tumores o neoplasias de tejidos sólidos .

Historia

El primer citómetro de flujo, basado en la impedancia y el principio de Coulter, fue desarrollado por Wallace H. Coulter y Mack Fulwyler en 1953 [1] . Coincidiendo con el descubrimiento del principio de Coulter, se publicó un artículo en la revista Science [2] .

El primer citómetro de flujo, por otro lado, fue desarrollado por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster el 18 de diciembre de 1968 [3] , producido por la empresa Partec y comercializado en 1968/1969 por la empresa alemana Phywe AG cerca de Göttingen.

En aquellos años se preferían los métodos analíticos de absorción a los de fluorescencia. Poco después, se desarrollaron citómetros de flujo que incluyen:

Origen del nombre

En principio, la definición de citometría de flujo basada en la fluorescencia (en abreviado citometría de flujo), se denominó citofotometría de pulso (del alemán: Impulszytophotometrie), basada en el primer instrumento patentado. En 1976, durante la 5ª Conferencia sobre Citología Automatizada de la Fundación Americana de Ingeniería, celebrada en Pensacola, Florida, ocho años después de la introducción del primer citómetro basado en fluorescencia, el nombre de citometría de flujo fue aceptado y rápidamente se hizo popular [4] .

Principios analíticos

El principio fundamental en el que se basa la citometría de flujo es la dispersión de la luz. El citómetro (o citómetro de flujo ) utiliza un flujo laminar de líquido (llamado líquido de envoltura, que significa envoltura, lo que significa que envuelve las células) para organizar las células en un flujo ordenado, constante y continuo, de modo que cada célula pueda ser traído (también llamado evento) en la cámara de conteo donde se llevará a cabo el análisis. El fenómeno de ordenar las células se denomina enfoque hidrodinámico .

En instrumentos con más de dos rayos láser (para dispersión frontal y lateral), llamados citofluorímetros , existen fuentes de luz que emiten longitudes de onda preestablecidas para la excitación de fluorocromos ligados a inmunoglobulinas ; estos complejos se utilizan para buscar marcadores celulares específicos como clusters de diferenciación , útiles para la definición de la línea celular a la que pertenece la muestra.

Las formas en que la luz que pasa a través de las celdas se distribuye tanto en la misma línea de haz ( dispersión frontal - dispersión frontal - FSC ), como lateralmente ( dispersión lateral - dispersión lateral - SSC ), proporcionan información respectivamente sobre el tamaño y la complejidad interna de la celda

Citometría de flujo

En la citometría de flujo, se utilizan anticuerpos monoclonales ligados a moléculas particulares, llamadas fluorocromos , es decir, moléculas capaces de emitir fluorescencia cuando se excitan con radiaciones de luz que tienen longitudes de onda específicas. Por lo tanto, los citómetros de flujo tienen tanto fuentes de luz específicas (para emitir radiación monocromática) como detectores específicos. Este análisis particular se utiliza para buscar marcadores celulares específicos, como grupos de diferenciación , útiles para la definición de la línea celular a la que pertenece la muestra. Gracias a la presencia de múltiples detectores en el mismo instrumento, es posible analizar simultáneamente múltiples parámetros en la misma adquisición. La citometría de flujo, además de ser una técnica de análisis cualitativo, gracias a una relación directamente proporcional entre la cantidad de fluorocromo y la intensidad luminosa de la radiación emitida (fluorescencia), también es posible obtener información sobre la cantidad de sitios de unión para el complejo antígeno.- anticuerpo-marcador presente en cada célula individual analizada.

Citómetros de flujo

Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar en tiempo real (es decir, con devolución inmediata de resultados y la capacidad de cambiar los parámetros de análisis mientras la adquisición está en curso) muchos miles de células por segundo. Un citómetro de flujo es similar a un microscopio, excepto que en lugar de producir una imagen de la célula, la citometría de flujo ofrece cuantificación automatizada a gran escala e inmunofenotipado de parámetros ópticos específicos para cada tipo de célula. Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales: una cámara de flujo, una cámara de recuento, un detector, un sistema de amplificación y una computadora para el análisis de señales.

Cámara de flujo

La cámara de flujo tiene forma para crear una corriente líquida (por medio de un fluido envolvente, o vaina líquida), que transporta y alinea las células para que atraviesen la cámara de conteo formando una sola línea que será analizada a través del haz de luz. para la detección de características físicas o inmunofenotípicas. El fenómeno hidrodinámico que subyace a la alineación celular es el enfoque hidrodinámico .

Cámara de conteo

La cámara de conteo es una parte del citómetro de flujo a través de la cual las células, previamente alineadas, se encuentran con los haces de luz que determinan la lectura de los eventos y su caracterización. Suele ser de material transparente, para que el operador pueda observarlo desde el exterior de la cámara, especialmente para comprobar la presencia de burbujas de aire que afectarían a la lectura de la muestra y por tanto al análisis.

Sistema de detección

El sistema de detección en los citómetros de flujo consta de:

Fuentes de luz

Las fuentes de luz en un citómetro de flujo pueden ser de varios tipos. Existen varios tipos de lámparas que emiten una radiación de luz más o menos monocromática, en función de la naturaleza del material del que está hecho el cátodo. Los más utilizados son:

Unidad óptica

La unidad óptica es un elemento necesario para dirigir los haces de luz sobre la corriente de fluido de la muestra y, posteriormente, tras ser absorbido/dispersado por la muestra, el haz pasa a través de un sistema de espejos y posiblemente prismas que actúan como monocromadores , para dirigir a los distintos detectores. El camino que sigue la luz para llegar al detector también se llama camino óptico .

Detector

El detector convierte las medidas analógicas de intensidad luminosa, transformándolas en una señal eléctrica para permitir que el software de gestión procese la señal y devuelva el resultado del análisis. Según el número de fuentes de luz (número de haces de luz monocromáticos) presentes, el número de detectores presentes en el instrumento también varía. Normalmente, los detectores son componentes capaces, como ya se ha mencionado, capaces de transformar una señal analógica (la intensidad del haz de luz) en una señal eléctrica, en forma de diferencia de potencial eléctrico o de corriente eléctrica. El dispositivo capaz de realizar esta tarea es el fotodetector (o fototubo) o, para la detección de intensidades muy bajas, el fotomultiplicador . Los instrumentos modernos suelen tener múltiples láseres y detectores de fluorescencia. El récord actual para un instrumento comercial es de diez láseres [5] y 30 detectores de fluorescencia [6] .

Sistema de procesamiento de datos

El sistema de procesamiento de datos consta de dos unidades principales:

CAD

Artículo principal: convertidor de analógico a digital

El convertidor de analógico a digital es un circuito electrónico capaz de convertir una señal analógica con una tendencia continua (por ejemplo, un voltaje eléctrico ) en una serie de valores digitales, útiles para el software de gestión de instrumentos para el procesamiento de datos.

Ordenador de gestión de instrumentos

El ordenador de gestión es un PC en el que está instalado un software de gestión que, como su nombre indica, es adecuado para gestionar el instrumento e interpretar los datos analíticos. Existen varios tipos de software, más o menos complejos, en función de su uso real; no hace falta decir que para fines de investigación, el software debe tener muchas más posibilidades de interacción con el instrumento en cuanto a los parámetros que se pueden configurar (por ejemplo, voltaje de las fuentes de luz, compensación de los detectores), en comparación con un software de diagnóstico que debe cumplir con criterios de reproducibilidad y repetibilidad y por lo tanto tener parámetros estándar y la posibilidad de calibración . La amplificación de las señales por parte del software puede ser lineal o logarítmica .

Marcadores

Marcadores fluorescentes

Se puede utilizar una amplia gama de fluoróforos como marcadores en la citometría de flujo. [7] Los fluoróforos normalmente se unen a un anticuerpo que reconoce un antígeno objetivo en la superficie o dentro de la célula. Los fluoróforos también se pueden vincular a una entidad química con afinidad por la membrana celular u otra estructura celular. Cada fluoróforo tiene una longitud de onda de emisión y excitación característica, y los espectros de emisión a menudo se superponen. En consecuencia, la combinación de marcadores que se puede utilizar depende de la longitud de onda de la(s) lámpara(s) o láser utilizados para excitar los fluorocromos y de los detectores disponibles. [8] Se cree que el número máximo de marcadores fluorescentes distinguibles es 17 o 18 y este nivel de complejidad requiere una optimización laboriosa para limitar los artefactos, así como complejos algoritmos de desconvolución para separar los espectros superpuestos. [9] La citometría de flujo utiliza la fluorescencia como herramienta cuantitativa; la sensibilidad máxima de la citometría de flujo no tiene comparación con otras plataformas de detección fluorescente, como la microscopía confocal . La sensibilidad absoluta a la fluorescencia suele ser menor en la microscopía confocal, ya que el sistema óptico confocal rechaza las señales desenfocadas y la imagen se construye en serie a partir de mediciones individuales en cada punto de la celda, lo que reduce la cantidad de tiempo disponible para recopilar la señal [10] [11]

Puntos cuánticos

Artículo principal: Puntos cuánticos .

Los puntos cuánticos se utilizan en lugar de fluoróforos en caso de que haya superposiciones espectrales de emisión.

La citometría de masas supera las limitaciones impuestas por el marcado fluorescente mediante el uso de isótopos de lantánidos unidos a anticuerpos. En teoría, este método podría permitir el uso de 40 o 60 marcas distinguibles y se han demostrado hasta 30 etiquetas. [9] La citometría de masas es fundamentalmente diferente de la citometría de flujo: las células se introducen en un plasma , posteriormente se ionizan y los isótopos asociados se cuantifican mediante espectrometría de masas. Aunque este método permite el uso de una gran cantidad de marcadores, actualmente tiene una capacidad de transmisión menor que la citometría de flujo. Este análisis es destructivo, impidiendo la recuperación de células por clasificación celular . [9]

Análisis de datos

Compensación

Cada fluorocromo tiene un amplio espectro de fluorescencia. Cuando se utiliza más de un fluorocromo, es posible que se produzca el solapamiento entre los espectros de emisión de los distintos fluorocromos, situación a evitar, ya que pueden darse fenómenos de interferencia de ondas y por tanto falsos positivos o negativos , condición a evitar. . Por ejemplo, el espectro de emisión de FITC se superpone a la misma longitud de onda que pasa por el filtro utilizado para PE. Esta superposición espectral se corrige eliminando una parte de la señal FITC de las señales PE o viceversa. Este proceso se llama compensación de color, que calcula la intensidad de la emisión de un fluorocromo como un porcentaje, para medirse a sí mismo. [12]

"La compensación es el proceso matemático mediante el cual corregimos los datos de intensidad de emisión espectral de los fluorocromos en citómetros de flujo multiparamétricos, por medio de superposición espectral. Esta superposición, o 'spillover', resulta del uso de tintes fluorescentes que se pueden medir en más de un detector; el desbordamiento está correlacionado por una constante conocida como coeficiente de desbordamiento. El proceso de compensación es una aplicación simple de álgebra lineal , cuyo objetivo es corregir el desbordamiento de todos los colorantes en todos los detectores, de modo que, a la salida, los datos sean efectivamente normalizados y que cada parámetro contiene información de un solo colorante. En general, nuestra capacidad de procesar datos es más efectiva cuando la visualización de datos se presenta sin correlaciones innecesarias” [12]

Puerta

Los datos generados por los citómetros de flujo se pueden ver en una sola dimensión para producir un histograma, en un diagrama bidimensional ( dispersión ).

o en gráficos incluso en tres dimensiones. Las regiones de estos gráficos se pueden separar secuencialmente según la intensidad de la fluorescencia, creando una serie de extracciones de subconjuntos, llamados "puertas" ( del inglés: gate, gate ). Existen protocolos de selección específicos para fines diagnósticos y clínicos, especialmente en relación con la hematología . Las células individuales a menudo se distinguen de pares o agregados más numerosos por su llamado "tiempo de vuelo" (también denominado "ancho de pulso") a través del rayo láser enfocado. [13] Los gráficos a menudo se construyen sobre una base logarítmica . Dado que los espectros de emisión de los diferentes tintes fluorescentes se superponen, las señales a los detectores deben compensarse electrónica y computacionalmente [7] . Los datos acumulados con el citómetro de flujo se pueden analizar con software, como JMP (software estadístico), WinMDI, [14] Flowing Software, [15] y Cytobank basado en web [16] (todo gratuito), Cellcion, Kaluza, FCS Express, FlowJo, FACSDiva, CytoPaint (también conocido como Paint-A-Gate), [17] VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt o Cytospec. [18] Una vez que se recopilan los datos, también llamada adquisición, no es necesario permanecer conectado al citómetro de flujo y, por lo tanto, el análisis se puede realizar en una computadora separada. Esto está especialmente extendido en estructuras centrales donde el uso de estas máquinas es muy demandado y compartido entre varios laboratorios o grupos de investigación.

Análisis Computacional

Los avances recientes en la identificación automática de poblaciones de células utilizando métodos computacionales han ofrecido una alternativa a las estrategias de selección tradicionales. Los sistemas de identificación automática podrían potencialmente ayudar a aislar poblaciones raras u ocultas. Los métodos analíticos automatizados incluyen FLOCK [19], la base de datos de inmunología y el portal de análisis (ImmPort), [20] SamSPECTRAL [21] . El algoritmo de incrustación de vecino estocástico distribuido en T (tSNE) es un algoritmo diseñado para realizar la reducción de dimensionalidad, para permitir la visualización de datos multidimensionales complejos en un "mapa" bidimensional. [22] Los esfuerzos de colaboración llevaron a un proyecto abierto llamado FlowCAP (Citometría de flujo: evaluación crítica de métodos de identificación de población, [23] ) para proporcionar una forma objetiva de comparar y evaluar métodos de agrupación en citometría de flujo y establecer pautas sobre el uso apropiado de estos métodos.

Aplicaciones

Esta tecnología tiene aplicaciones en numerosos campos, incluyendo biología molecular , patología , inmunología , biología vegetal y biología marina [24] . Tiene una amplia aplicación en medicina , especialmente en trasplante, hematología, inmunología y quimioterapia del cáncer, diagnóstico prenatal, genética y selección espermática para preselección de sexo. Además, es ampliamente utilizado en investigación para la detección de daños en el ADN, [25] escisión de caspasa y apoptosis celular . [26] En neurociencia también es posible analizar la coexpresión de antígenos de superficie celular y antígenos intracelulares. [27] En biología marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosintético pueden explotarse mediante citometría de flujo para caracterizar la abundancia y la estructura de la comunidad. En la ingeniería de proteínas ( proteómica ), la citometría de flujo se utiliza junto con la visualización de levaduras y bacterias para identificar variantes de proteínas de la superficie celular.

Notas

  1. ^ Espacenet : datos bibliográficos , en worldwide.espacenet.com . Consultado el 2 de mayo de 2018 .
  2. ^ MJ Fulwyler, Separación electrónica de células biológicas por volumen , en Science , vol. 150, núm. 3698, 12 de noviembre de 1965, págs. 910-911, DOI : 10.1126/ciencia.150.3698.910 . Consultado el 2 de mayo de 2018 .
  3. ^ Espacenet : datos bibliográficos , en worldwide.espacenet.com . Consultado el 2 de mayo de 2018 .
  4. ^ Saco, Ulrich; et al. Zelluläre Diagnostik . Editorial Karger (2006).
  5. ^ Recursos y equipo : Instituto Centenario , en centenary.org.au . Consultado el 3 de mayo de 2018 .
  6. ^ PRODUCTOS DE PEDIDO ESPECIAL - analizadores | BD Biosciences-US , en bdbiosciences.com . Consultado el 3 de mayo de 2018 .
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  10. ^ David A. Basiji, William E. Ortyn, Luchuan Liang, Vidya Venkatachalam y Philip Morrissey, Cellular Image Analysis and Imaging by Flow Cytometry , en Clinics in Laboratory Medicine , Flow Cytometry, vol. 27, núm. 3, 1 de septiembre de 2007, págs. 653-670, DOI : 10.1016/ , ISSN  0272-2712 .
  11. ^ David A. Basiji, William E. Ortyn y Luchuan Liang, Análisis de imágenes celulares e imágenes por citometría de flujo , en Clínicas de medicina de laboratorio , vol. 27, núm. 3, 2007-9, págs. 653 – viii, DOI : 10.1016 / j.cll.2007.05.008 . Consultado el 3 de mayo de 2018 .
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Bibliografía